Naudingos pastabos apie limfocitų aktyvinimo tyrimus

Limfocitų funkciniai pajėgumai, reaguojant į antigenus ar mitogenus, nustatomi limfocitų aktyvinimo tyrimais.

Taigi, limfocitų aktyvinimo tyrimai yra tinkamesni individualaus imunokompetencijos vertinimui nei paprastas limfocitų skaičius.

Yra dviejų tipų limfocitų aktyvinimo tyrimai:

i. „Aktyvinimo žymenų“ nustatymas limfocitų paviršiuje.

ii. Limfocitų gebėjimo daugintis po T ląstelių stimuliacijos įvertinimas.

Dažniausiai naudojami T ląstelių stimulai, skirti T limfocitų proliferacijai įvertinti yra:

i. Lektinai [pvz., Fitohemagliutininas (PHA) ir konanavalinas A (ConA)

ii. Bakteriniai toksinai, veikiantys kaip super antigenai

iii. Cheminiai junginiai [pvz., Phorbal miristato acetatas (PMA), kalcio jonoforai

iv. Citokinai

v. paviršinių receptorių mAb (ypač CD3 molekulės T ląstelėse)

B ląstelių aktyvinimą sukelia:

i. Pokeweed mitogenas (PWM). PWM taip pat aktyvuoja T ląsteles

ii. Super antigenai

iii. Lipopolizacharidai

iv. mAbs, kurie kerta nuorodą į B ląstelių paviršių.

a. Išgryninti limfocitai yra kultivuojami 96 šulinėlių mikrolitų šulinėliuose ir stimuliuojami antigenu arba mitogenu (paprastai 48 valandas).

↓

Į šulinėlius pridedamas tritijuotas timidinas (3H-Tdr) ir inkubuojamas

↓

Šulinių turinys įsiurbiamas ir filtruojamas filtruose, ir matuojamas ³ H Tdr kiekis filtravimo popieriuje. ³ H-Tdr įtraukimas į chromosomų DNR atspindi ląstelių proliferaciją.

b. Ląstelių proliferacijai nustatyti yra netradiciniai tyrimai. Šie tyrimai naudoja fluorescuojančius dažiklius, kurie įterpia į DNR arba dažiklius, kurie matuoja oksidacinį kvėpavimą, pvz., MTT.

c. Bromodoksiuridinas (BrdU) yra įtrauktas į labai dauginančių ląstelių DNR ir todėl gali būti panaudotas ląstelių proliferacijai įvertinti. Įtraukti BrdU ląstelėse aptinkami naudojant mAb nuo BrdU ir srauto citometrijos (pvz., Ląstelių antigenų aptikimas srauto citometrija).

BrdU taip pat gali būti skiriamas vėžiu sergantiems pacientams in vivo, o vėliau navikas gali būti perskirstytas, o naviko ląstelės gali būti įvertintos, kad būtų galima įtraukti BrdU. Šis tyrimas suteikia idėją apie auglio ląstelių proliferacinę frakciją paciente.

d. Citotoksinis T ląstelių aktyvavimas nustatomas ⁵¹ chromo išsiskyrimo tyrimu:

Tikslinės ląstelės yra paženklintos radioaktyviu chromu ( ⁵¹ Cr), kuris prisijungia prie ląstelių ląstelių baltymų.

↓

Pažymėtos tikslinės ląstelės inkubuojamos su citotoksinėmis T ląstelėmis.

↓

Cituojančių T ląstelių ląstelių lizė lemia ⁵¹ Kr.

Ląstelės centrifuguojamos ir išmatuotas supernatante išleistas ⁵¹ Kr. Išleisto ⁵¹ Cr kiekis yra proporcingas ląstelių lizei.