HLA: Histocompatibility Testing Methods

Histocompatibility Testing Methods!

HLA sistema yra plačiai polimorfinė. HLA alelių polimorfinis pobūdis iš pradžių buvo rastas ir nustatytas serologiniais metodais, o HLA antigenams buvo pateikti skaičiai. Vėliau buvo nustatyta, kad antigenai su tuo pačiu serologiniu specifiškumu gali turėti skirtingas aminorūgščių sekas. Iki 1999 m. Žinomų HLA alelių skaičius viršijo 1000, o skaičius vis dar didėja. Dėl plataus polimorfizmo HLA alelių nomenklatūra yra sudėtinga ir asmeniui taip pat sunku suprasti nomenklatūrą, nebent asmuo yra histocompatibilumo lauke.

Pirmieji suskirstyti aleliai buvo priskirti vardams su dviem skaitmenimis, atitinkančiais jų serologinę specifiką. Pirmiesiems dviem skaitmenims seka dar du skaitmenys, nurodantys PSO nomenklatūros komiteto HLA sistemos veiksnių pavadinimų chronologinę tvarką. (Pavyzdžiui, pirmasis alelis, suskirstytas iš HLA-A2 geno, buvo pavadintas HLA-A 0201, o antrasis suskirstytas alelis buvo pavadintas HLA-A 0202.)

HLA tipavimas atliekamas taikant serologinius tipavimo metodus arba molekulinius tipavimo metodus. Serologiniai HLA tipavimo metodai aptinka HLA molekulių epitopus, o molekuliniai metodai nustato nukleotidų sekas.

i. HLA tipavimas, apibūdinantis alelių grupes (paprastai apytiksliai serologines savybes), vadinamas mažos skiriamosios gebos arba bendriniu tipavimu (pvz., HLA-DRBl-04).

ii. Rašymas, kuris išsprendžia visas žinomas aleles, vadinamas aukšto raiškos HLA tipavimu (pvz., HLA-DR BI x401).

iii. Tipavimas, kuris išsprendžiamas už serologinių savybių ribų, bet neužtikrina alelio lygio, vadinamas tarpiniu-išsprendimu (pvz., HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

Nacionalinė smegenų donorų programa sukūrė kodą, kad palengvintų šių sudėtingų tarpinės rezoliucijos duomenų valdymą. Šioje sistemoje HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / yra pavadinimas DRBl-04EJV.

Histologiniai suderinamumo tyrimai pagal serologinius metodus:

Limfocitai naudojami serologiniam ŽLA tipui, antikūnų atrankai ir kryžminiam suderinimui.

Limfocitų išskyrimas HLA tipui:

i. Periferinis veninis kraujas sumaišomas su Ficoll-Hypaque ir centrifuguojamas. Sluoksnis, kuriame yra periferinių kraujo mononuklinių ląstelių, yra išsiurbiamas, plaunamas ir naudojamas.

ii. Naudojami limfocitai, išskirti iš limfmazgių ir blužnies.

iii. II klasės antigenų HLA tipavimas atliekamas su praturtintomis B ląstelių populiacijomis (maždaug 80 proc. Normalių periferinių kraujo T ląstelių atpalaiduoja T ląsteles, kurių paviršiuje nėra II klasės antigenų).

iv. Anti-CD2 arba anti-CD3 mAb dengtos magnetinės granulės naudojamos T ląstelių izoliavimui; ir anti-CD19 mAb dengtos magnetinės granulės naudojamos B ląstelių izoliavimui.

Limfocitų HLA antigenų aptikimas:

Mikro citotoksiškumo tyrimas yra priklausomas nuo komplemento limfos citotoksiškumo tyrimas. Šaldyti tipavimo padėklai, kuriuose yra šulinių, padengtų skirtingais antikūnais prieš HLA antigenus, yra komerciškai prieinami.

Į kiekvieną dėklo šulinėlį išpilstoma maždaug 2000 limfocitų ir 30 minučių inkubuojama kambario temperatūroje. (Antikūnai kiekvienoje šulinėlyje jungiasi prie specifinių HLA antigenų limfocitų paviršiuje, jei yra.)

↓

Į kiekvieną šulinėlį įpilama 5 µl komplemento (paprastai, triušio serumas) ir inkubuojama 60 minučių (komplemento baltymai sukelia limfocitų, kurie yra padengti mAb, mirtį. Nesant mAb surišimo limfocitais, komplementas nėra aktyvuojamas ir limfocitai nėra nužudyti).

↓

Pridedama dažų eozino Y, po kurio formaldehidas (formaldehidas fiksuoja reakciją).

↓

Tuomet kiekviename šulinyje negyvos ląstelės ir gyvos ląstelės skaičiuojamos pagal fazinio kontrasto mikroskopą.

i. Ištinusios ir tamsios ląstelės yra negyvos ląstelės (dažų eozinas Y patenka į negyvas ląsteles).

ii. Ryškios ir refrakcijos ląstelės yra gyvos ląstelės (dažų eozinas Y nepatenka į gyvas ląsteles).

Kiekvienas padėklo šulinys yra peržiūrimas atskirai negyvoms ląstelėms ir gyvoms ląstelėms. Nuskaičiuotų ląstelių procentinė dalis kiekviename šulinyje apskaičiuojama ir taškų skaičiavimas atliekamas pagal 27.5 lentelę.

27.5 lentelė. HLA limfos citotoksiškumo bandymo įvertinimas:

Asmens HLA tipas nustatomas interpretuojant individo limfocitų reakciją su skirtingais antiserumais, naudojamais komplemento priklausomame limfos citotoksiškumo tyrime.

i. Tikimasi, kad kiekvienas asmuo turi du HLA-A, du HLA-B ir du HLA-C antigenus limfocitų paviršiuje.

ii. Jei tiriamojoje tiriamojoje yra tik vienas HLA-A arba HLA-B arba HLA-C antigenas, tikriausiai tas asmuo yra homozigotinis šiam konkrečiam antigenui arba teste naudojamo antiserumo grupė neturi specifinio antikūno prieš antrąjį antigenas arba yra maža HLA molekulių ekspresija limfocitų paviršiuje.

HLA-DR ir HLA-DQ antigenų komplemento priklausomas limfos citotoksiškumo tyrimas atliekamas naudojant B ląsteles, išskirtas padengtais magnetiniais karoliukais arba B ląstelėmis, izoliuotomis per nailono vilną.

Dauguma HLA tipavimo serumų gaunami iš daugialypių moterų. Kadangi mutioparinės moterys yra pakartotinai veikiamos vaisių HLA antigenais, daugiašalių moterų serumai turi antikūnų prieš HLA antigenus. Beveik 200 skirtingų antiserumų yra naudojami žmogaus ŽLA antigenams įvesti.

Iš pradžių buvo manoma, kad kiekvienam HLA antigenui gali būti sukurta mAb ir HLA tipavimas būtų paprastas. Tačiau daugelis mAbs jungiasi prie bendrų epitopų, o ne privačių HLA antigenų epitopų. Be to, daugelis pelių mAb nepašalina komplemento (todėl jų naudojimas komplemento priklausomiems limfos citotoksiškumo tyrimams yra ribotas).

Tačiau pelių mAb gali būti naudojami ELISA metodu ir srauto citometrijos metodu, kuriems nereikia papildymo. Vėliau daugelis laboratorijų pageidauja naudoti molekulinį HLA tipavimą, o ne serologinį HLA tipavimą.

Transplantato gavėjo serumo, skirto antikūnams prieš l-ILA antigenus, atranka (antikūnų atranka):

Antikūnų prieš HLA antigenus buvimas laukiančio organo transplantato recipiento serume paprastai atliekamas priklausomai nuo komplemento priklausomo limfos citotoksiškumo. Limfocitai su žinomais HLA antigenais ir komplementu yra sumaišyti su recipiento serumu. Po atitinkamo inkubavimo skaičiuojami negyvi limfocitai ir gyvi limfocitai. Apskaičiuojamas procentinis plokštelės reaktyvusis antikūnas (PRA).

PRA = teigiamų ląstelių skaičius / bendras plokščių skaičius x 100

PRA nurodo laukiančio recipiento jautrumo HLA antigenams laipsnį.

Serumo HLA antikūnų ELISA metodas:

ELISA metodas yra paprastas, greitas ir nereikalauja gyvų limfocitų bei papildo. Iš mikrotitravimo plokštės sienų padengiami afinitetu išgryninti HLA antigenai

↓

Pridedamas ir inkubuojamas gavėjo serumas

↓

Po plovimo pridedama ir inkubuojama fermentų konjuguota anti-žmogaus IgG.

↓

Po plovimo pridedama substrato ir inkubuojama.

i. Spalvos vystymasis tam tikroje šulinėje rodo, kad IgG antikūnai prieš HLA antigeną yra padengti tuo pačiu šuliniu.

ii. Spalvos nebuvimas tam tikroje šulinėje rodo, kad nėra antikūnų prieš tam tikrą HLA antigeną, padengtą tuo pačiu šuliniu.

Srauto citometras, skirtas aptikti serumo HLA antikūnus:

Mikro rutuliukai, padengti HLA antigenais, inkubuojami su paciento serumu ir po to su fluorescenciniais žymimais anti-žmogaus IgG antikūnais. Per foną nukreiptų karoliukų procentinė dalis rodo paciento reaktyviųjų antikūnų (PRA) procentinį dydį.

Kryžminis atitikimas:

Jei laukiančio recipiento kraujas turi antikūnų prieš donoro HLA antigenus, transplantacijos metu donoro ląstelių HLA antigenai bus užpulti. Todėl prieš transplantaciją būtina žinoti, ar recipientas turi antikūnų prieš donoro HLA antigenus.

Jei donoro HLA antigenų specifiniai antikūnai yra recipiento serume, persodinimas bus atmestas. Kryžminis suderinimas atliekamas norint nustatyti laukiančio recipiento serumo antikūnų buvimą prieš siūlomus donoro HLA antigenus.

Limfos citotoksiškumas Kryžminis suderinimas su periferiniais kraujo limfocitais:

Siūlomo donoro periferiniai kraujo limfocitai (kurių apytiksliai yra 80 procentų T ląstelių (kurios turi I klasės I klasės antigenus) ir 20 proc. B ląstelių ir monocitų (kurie turi I ir II klasės antigenus MHC) yra sumaišomi su laukiančio recipiento serumu ir inkubuojami .

↓

Pridedama ir inkubuojama komplementas.

↓

Įpilama ir inkubuojama dažų eozinas Y.

i. Skaičiuojamas negyvų ir gyvybingų ląstelių skaičius ir apskaičiuojama negyvų ląstelių procentinė dalis. 50 procentų ar daugiau ląstelių mirties rodo stiprią teigiamą kryžminę rungtynę (ty gavėjo serume yra antikūnų, galinčių reaguoti su donoro HLA antigenais). Stiprus teigiamas kryžminis ryšys tarp recipiento ir siūlomo donoro yra organų transplantacijos kontraindikacija nuo donoro iki recipiento.

Siekiant nustatyti, ar recipiento antikūnai yra nukreipti prieš I ar II klasės antigenus, atliekami T ląstelių limfos citotoksiškumo kryžminiai atitikmenys (naudojant praturtintas T ląsteles) arba B ląstelių limfos citotoksiškumo kryžminis suderinimas (naudojant praturtintas B ląsteles).

Srautinio citometro kryžminis suderinimas yra 30-250 kartų jautresnis nei vizualiniai serologiniai metodai IgG antikūnų prieš HLA antigenus nustatymui limfocitų paviršiuje.

Siūlomo donoro periferiniai kraujo limfocitai yra inkubuojami su paženklintais (pvz., Fluorescenciniais dažais, kurie išskiria žalias šviesas) anti-CD3 mAb, kurie jungiasi prie T ląstelių.

↓

Pažymėtos ani-CD3 surištos T ląstelės yra atskiriamos nuo B ląstelių srauto citometre.

↓

Atskiros, dažytos T ląstelės dabar inkubuojamos su laukiančio recipiento serumu.

i. Gavėjo serumo antikūnai prieš donoro T ląstelių HLA antigenus, jei jie yra, prisijungs prie T ląstelių.

↓

Po plovimo pridedama ir inkubuojama flurochromo (kuris išskiria spalvą, išskyrus žalią, ty raudoną spalvą), pažymėtą anti-žmogaus IgG.

ii. Florochromu pažymėtas anti-žmogaus IgG prisijungs prie recipiento HLA antikūnų, kurie yra prijungti prie donorų T ląstelių.

Srauto citometras skaičiuoja T ląstelių (raudonos ir žalios spalvos) ir T ląstelių (žalios spalvos) skaičių ir sukuria histogramą.

Kryžminis suderinimas prieš limfocitus veikiančius autoantikūnus:

Kryžminio suderinimo metu autoantikūnai prieš limfocitus, esančius recipiento serume, gali nesugebėti specifiškai susieti su donorų limfocitais ir gauti klaidingą teigiamą kryžminį rezultatą; ir todėl donoras klaidingai diskvalifikuotas iš organų donorystės konkrečiam gavėjui. Autoantikūnai taip pat gali slėpti specifinių antikūnų prieš donorus buvimą.

Auto-antikūnų buvimą limfocituose aptinka automatinis kryžminis suderinimas, kuriame gavėjo limfocitai ir serumas yra sujungti į standartinį citotoksiškumo tyrimą. Autoantikūnų kryžminiai atitikmenys yra reguliariai atliekami kartu su visais gyvais donorų kryžminiais atitikmenimis kiekvienam išbandytam serumui.

HLA tipavimo molekulinės biologijos metodai:

Dauguma molekulinių tipavimo metodų naudoja polimerazės grandinės reakcijos (PCR) metodą, kad selektyviai padidintų tipui reikalingus HLA genų segmentus.

Pagal seką priklausantis pradinis (SSP) tipavimas:

Asmens DNR išskiriama iš ląstelių arba audinių

↓

DNR pridedama prie mėgintuvėlių, turinčių skirtingų pradmenų rinkinių skirtingiems HLA genams. Papildomas pradmenų rinkinys yra įtrauktas kaip teigiamas amplifikacijos kontrolė visuose mėgintuvėliuose.

↓

Pridedamos kitos PCR reakcijos sudedamosios dalys (pvz., DNR nukleotidai, DNR polimerazė, buferis) ir atliekamas terminis ciklavimas.

↓

Amplifikuoti produktai elektroforezuojami gelyje su etidžio bromidu ir fotografuojami UV šviesoje.

i. Juostos buvimas rodo, kad DNR mėginys turi seką, atitinkančią tam tikrą HLA tipą.

ii. Juostos nebuvimas rodo, kad DNR mėginyje nėra konkrečios HLA tipo sekos.

iii. Vidaus stiprinimo valdymo juosta turi būti aiškinama.

HLA tipavimo pradmenų rinkiniai yra komerciškai prieinami.

i. HLA-A, B ir C tipams reikia maždaug 100-200 reakcijų.

ii. HLA-DRB tipui reikia apie 20-30 reakcijų.

Sekvencinei specifinei oligonukleotidų zondo hibridizacijai (SSOP):

SSOP metodas apima selektyvų HLA tikslo stiprinimą, po to hibridizaciją į oligonukleotidinių zondų plokštę. Yra du SSOP formatai.

i. Taškinis arba lizdas:

Amplifikuota DNR yra prijungta prie kieto pagrindo (pvz., Nailono membranos) ir hibridizacijos zondas yra tirpale.

ii. Atgalinis taškas arba lizdas:

Zondas yra prijungtas prie kieto pagrindo ir hibridizuojamas su amplifikuota DNR tirpale.