Neutrofilų funkcijos tyrimai

Neutrofilų funkcijos tyrimai!

1. Neutrofilų chemotaksą galima įvertinti šiais būdais:

a. Modifikuotas Boyden kameros tyrimas:

„Boyden“ kamera susideda iš viršutinės ir apatinės kameros, atskirtos mažo porų dydžio filtru.

Neutrofilų suspensija dedama į viršutinę kamerą ir į apatinę kamerą dedama chemotaktinė medžiaga. Neutrofilų migracijos mastas vertinamas skaičiuojant į filtrą įstrigusių neutrofilų skaičių ir neutrofilų skaičių apatinėje kameroje srauto citometrijos būdu.

b. Gręžiniai išspaudžiami į pusiau kietą agarą:

Neutrofilų suspensija, chemotaktinė medžiaga ir ne chemotaktinė medžiaga dedamos į skirtingus gręžinius. Mikroskopiškai nustatoma ląstelių migracija per pusiau kietą agarą į chemotaktinę medžiagą. Migracija į ne chemotaktinę medžiagą gerai rodo atsitiktinį ląstelių judėjimą (žinomas kaip chemo kinezė).

2. Neutrofilų fagocitozė:

Neutrofilų fagocitiniam pajėgumui įvertinti gali būti naudojamos įvairios dalelės. Dalelės yra inkubuojamos su neutrofilais ir vėliau mikroskopiškai stebimos, ar nėra dalelių neutrofilų viduje. Su ląstelėmis susietos dalelės pašalinamos rūgštiniu būdu, kad su ląstelėmis susietos dalelės nebūtų skaičiuojamos kaip ląstelių dalelės.

Taip pat yra prieinamos fluorescencinės arba radioaktyviosios dalelės, kurios leidžia tiesiogiai suskaičiuoti daleles fagocitais.

3. Kvėpavimo sprogo ir degranuliacijos nustatymas:

Lėtinė granulomatinė liga (CGD) yra imunodeficito liga, kurioje intrakelitinis žudymas fagocitais yra paveiktas dėl fagocitinių ląstelių nesugebėjimo gaminti superoksido anijoną (O2 ^- ).

a. Nitroblue tetrazolium (NBT) skaidrių bandymas:

NBT yra skaidrus, geltonas, vandenyje tirpus dažiklis. NB2 yra sumažintas iki giliai mėlynos, formazono O ₂ ^- . Neutrofilai aktyvuojami gydant PMA arba veikiant LPS. Po to aktyvuoti neutrofilai inkubuojami su NBT. Jei neutrofilai gamina O2, NBT redukuojama iki giliai mėlynos formazono ir vizualizuojama mikroskopu. Kiekybinį tyrimą galima atlikti ekstrahuojant formazoną iš neutrofilų ir tiriant formazoną spektrofotometru. Vaikai, kuriems visai trūksta NADPH oksidazės aktyvumo, rodo didelį NBT testo trūkumą. Tačiau vaikai, kurių dalinis NADPH oksidazės aktyvumo praradimas yra geriau, nustatomi kiekybiniu tyrimu.

b. Srauto citometrinis tyrimas, naudojant 2'7′-dichlorfluorceiną (DCF):

O2 ^-, susidaręs NADPH oksidazės aktyvumo metu, fermento superoksido dismutazės pavidalu konvertuojamas į H2O2. H ₂ O ₂ yra kita mikrobicidinė cheminė medžiaga. H202 oksiduoja fluorescencinį junginį DCF į fluorescencinį junginį, kuris aptinkamas srauto citometru.

Fagocitai inkubuojami su DCF ir DCF patenka į ląsteles.

↓

Tada neutrofilus aktyvuoja PMA arba kiti agentai.

↓

Tada ląstelės analizuojamos srauto citometru. Nustatomas fagocitų fluorescencijos padidėjimas.

Srauto citometras taip pat leidžia kiekybiškai nustatyti atskirų ląstelių pagamintą H2O2. Taigi srauto citometrinė analizė yra naudinga nustatant dalinius defektus NADPH oksidazės funkcijoje arba atrankos būdu, kai yra heterozigotiniai XG susietos formos CGD.

4. Fagocitų degranuliacija:

Fagocitinė degranuliacija yra lizosomų su fagosomomis sintezės procesas, dėl kurio lizosomų kiekis išsiskiria į fagolizosomą. Degranuliavimas yra aktyvus procesas, kuriam reikia energijos. Normalių neutrofilų metabolinių takų sutrikimas (ypač deguonies suvartojimas ir gliukozės gliukozė per heksozės monofosfato šuntą) trukdo degranuliacijai; dėl šios priežasties paveikiama fagocitų mikrobų žudymas.

Fagocitų suspensijoje degranuliavimą gali sukelti įvairūs aktyvuojantys agentai ir junginiai, kurie veikia ląstelių citozeloną (pvz., Citochalasiną B). Fagocitai išskiria daugiausia antrinių ir tretinių granulių ir jie matuojami ELISA metodais.

i. Laktoferrinas (antrinė neutrofilų granulė) yra naudojamas kaip antrinės granulių išsiskyrimo žymuo.

ii. Albuminas vertinamas kaip terciarinių granulių išsiskyrimo matas.

Pirminio granulių išsiskyrimo iš fagocitų tyrimas atliekamas ieškant pirminių granulių išsiskyrimo į uždaras vietas. „Nusivylęs fagocitozė“ yra tyrimas, naudojamas pirminių granulių išsiskyrimui įvertinti (27.7 pav.).

Šilumos agreguoti imunoglobulino arba imuniniai kompleksai yra pritvirtinti prie petridų.

↓

Neutrofilai pridedami prie petridų ir inkubuojami. Per savo Fc receptorius, neutrofilai prisijungia prie šilumos agreguotų imunoglobulino arba imuninių kompleksų Fc regionų. Todėl neutrofilai bando fagocituoti šilumos agreguotus imunoglobulino arba imuninius kompleksus. Tačiau neutrofilai negali fagocituoti jų (nes jie yra pritvirtinti prie Petri lėkštelės). Todėl neutrofilai išleidžia granulių turinį.

↓

Degranuliacijos įvertinimui naudojama pirminių granulių baltymų, tokių kaip mieloperoksidazė arba β-gliukoronidazė, išsiskyrimo greitis. Pirminių / antrinių granulių sintezės trūkumai taip pat gali būti aptikti, dažant intracelulines granules su pažymėtomis mAb ir srauto citometrija.

Neutrofilų žudymas bakterijomis:

Mikrobicidinius tyrimus sunku atlikti. Apskritai mikrobicidiniai tyrimai atliekami, kai daugiau paprastų tyrimų nepateikia pakankamai informacijos.

Staphylococcus aureus 502A padermė paprastai naudojama neutrofilų mikrobicidiniam pajėgumui įvertinti.

Staphylococcus aureus 502A štamas, augantis log fazėje, inkubuojamas su žmogaus serumais (kad gautų imunoglobulino ir komplemento baltymus, kad jie veiktų kaip opsoninai).

↓

Naujai izoliuoti neutrofilai pridedami 5-10 bakterijų / neutrofilų koncentracijoje.

↓

Po 30 minučių inkubacijos bakterijos, kurios neužterštos neutrofilais, žudomos pridedant gentamicino. (Gentamidnas nepatenka į neutrofilus, todėl fagocitozuotos bakterijos išlieka gyvos.)

↓

Neutrofilų alikvotinės dalys pašalinamos per 30 minučių ir sumaišomos su steriliu distiliuotu vandeniu neutrofilų lizei ir bakterijų atpalaidavimui. Gyvybingų bakterijų skaičius kiekvienoje alikvotinėje dalyje matuojamas serijiniu praskiedimu ir padengimu ant kraujo agaro plokštelių.

↓

Rezultatai pateikiami grafike.

i. Normalūs neutrofilai po dviejų valandų inkubacijos rodo gyvybingų intracelulinių bakterijų sumažėjimą dviem logais.

ii. Beveik neutrofilai neišmuša homozigotinių CCD pacientų.

iii. Neutrofilai iš heterozigotinių CGD nešėjų parodo dalinį naikinimą neutrofilais.