Eksperimentas bakterijų dažymui (su paveikslu)

Perskaitykite šį straipsnį, kad sužinotumėte apie eksperimentą, skirtą atlikti bakterijų dažymą gramais, kad sužinotumėte, ar jis yra gramteigiamas ar gram-neigiamas!

Tikslas:

Svarbiausias diferencinis dažymas, naudojamas mikrobiologijoje, yra gramų dažymas.

Jis pavadintas dr. Christiano Gramo vardu, kuris, remdamasis savo ląstelių sienelės sudėties skirtumais, suskirstė bakterijas į dvi grupes:

(1) Gram-teigiamos bakterijos:

Nuspausdinus bakterijas kristaliniu violetiniu, jei jo ląstelių sienelė priešinasi nudažymui, nuplaunant spalvos šalinimo agentu (etanoliu arba acetonu), tai yra gramteigiamos bakterijos. Pavyzdžiai: Bacillus, Staphylococcus.

(2) Gram-neigiamos bakterijos:

Nuspausdinus bakterijas kristaliniu violetiniu, jei jo ląstelių sienelė leidžia nuvalyti spalvą, nuplaunant spalvą mažinančią medžiagą (etanolį arba acetoną), tai yra gram-neigiamos bakterijos. Pavyzdžiai: Escherichia, Salmonella, Vibrio.

Bakterijų diferencijavimas į gramteigiamas ir gramnegatyvias grupes suteikia svarbiausią raktą tolesniam tolimesniam tolimesniam tikslui nustatyti nežinomų bakterijų identifikavimui. Jis taip pat naudingas paprastam bakterijų diferenciacijai į gramteigiamas ir gramneigiamas grupes. Taip pat pateikiama idėja apie bakterijų ląstelių formą ir išdėstymą.

Principas:

Gramos dažymo metu bakterijų ląstelės pirmą kartą nudažomos pirminiu dažikliu, kristaliniu violetiniu, kuris patenka į ląsteles ir nudažo jas violetinės-mėlynos spalvos. Tuomet ląstelės yra apdorojamos gleivine, gramo jodu, kuris patenka į ląsteles ir jungiasi prie pirminės dėmės, sudarančios netirpų dažų tirpiklio kompleksą (kristalinės violetinės-jodo kompleksą), todėl dėmių išsiskyrimas yra sunkus.

Tada ląstelės apdorojamos spalvos šalinimo agentu, tokiu kaip etanolis arba acetonas. Jis veikia kaip lipidų tirpiklis ir kaip baltymų dehidratavimo agentas. Gram-teigiamose ląstelėse spalvinimo agentas iš pradžių veikia kaip lipidų tirpiklis, ištirpindamas nedidelį kiekį ląstelių, esančių ląstelės sienelėje, taip sudarydamas minutę poras. Vėliau ji dehidratuoja ląstelių sienelių baltymus (peptidus), kurie uždaro poras.

Dabar dekolantų kompleksą sunku pašalinti šalinančiu agentu, o ląstelės išlaiko violetinės ir mėlynos spalvos pirminę dėmę. Kai priešprieša nudažyta rausvai raudona spalva, safraninas, jis negali patekti į ląsteles, nes poros buvo uždarytos.

Galiausiai ląstelės išlaiko raudonos ir mėlynos spalvos pirminę dėmę. Kita vertus, gram-neigiamoje ląstelių sienelėje yra didelis lipidų kiekis (LPS), kuris išsiskiria išgarinančio agento, todėl susidaro didelės poros. Šių porų ląstelių sienelių baltymų dehidratacija nėra labai artima.

Štai kodėl; dėmių tirpiklio kompleksas išsilieja per poras, kai jį nuplauna išgarinančiu agentu, o ląstelės yra bespalvės. Kai prieš tai nusidažo safraninas, jis patenka į ląsteles per poras, o galiausiai ląstelės ima rožinės ir raudonos spalvos kontrastinį atspalvį.

Reikalingos medžiagos:

Pristatymas, kilpa, pirminė dėmė (kristalinė violetinė spalva), apnašas (gramo jodas), spalvinimo agentas (95% etanolis), priešpilis (safraninas), sultinio / šlaito / plokščių bakterijų kultūra, mikroskopas, panardinimo alyva.

Procedūra:

1. Skaidriukas tinkamai išvalomas po vandentiekio vandeniu, kad vanduo neišliktų ant jo paviršiaus (5.11 pav.).

2. Prilipęs vanduo nuvalomas bibuliuojančiu popieriumi ir skaidrė džiovinama oru.

3. Bakterijų tepinėlis paruošiamas skaidrių centre dviem būdais, kaip nurodyta toliau.

(a) Jei reikia laikytis agaro plokštelėje arba agaro sluoksnyje išaugintos bakterijos, į stiklelio centrą dedamas vandens lašas, o bakterijų kilpa iš plokštelės arba nuožulnios juostos perkeliama į jį per liepsnos sterilizuotą kilpą. Tada, lėtai sukant ciklą laše, gaminama bakterijų suspensija ir pasklinda, kol gaunamas tepalas.

(b) Jei reikia stebėti skystame sultinyje auginamą bakteriją, bakterijų suspensijos lašas liepsnos sterilizuota kilpa tiesiai įstumiamas į stiklelio centrą ir skleidžiamas tepalas.

4. Tepalas išdžiovinamas ore.

5. Tepalas tvirtinamas kaitinant. Šildymas sukelia ląstelių baltymų koaguliaciją, dėl kurių ląstelės prilimpa prie slydimo paviršiaus ir negauna plovimo dažymo metu. Šilumos fiksavimas atliekamas greitai perduodant stiklą aukščiau virš liepsnos 2-3 kartus. paviršius, nukreiptas į viršų, kad tepinėlis nebūtų pašildomas.

6. Stiklelis laikomas ant dažymo dėklo ir 1 minutę užtvindytas pirminiu dažikliu, kristaliniu violetu.

7. Perviršinis dėmės nuplaunamos nuo tepinėlės švelniai tekančiu vandentiekio vandeniu taip, kad vanduo nepatektų tiesiai į tepinėlį.

8. Tepalą 1 minutei užtvindo grynasis gramo jodas.

9. Pernelyg didelis skystis nuplaunamas nuo tepinėlės švelniai tekančiu vandentiekio vandeniu taip, kad vanduo nepatektų tiesiai į tepinėlį.

10. Tepalą 5 sekundes užtvindo skiedikliu, 95% etanoliu, taip, kad tepinėlis nebūtų pernelyg spalvotas.

11. Etanolis greitai nuplaunamas nuo tepinėlės švelniai tekančiu vandentiekio vandeniu, kad būtų išvengta pernelyg ryškios spalvos. Reikia imtis atsargumo priemonių, kad vanduo nepatektų tiesiai į tepinėlį.

12. Tepalą užtvindo priešprieša, safraninas, 1 minutę.

13. Pernelyg didelis priešpriešas nuplaunamas nuo tepinėlio švelniai tekančiu vandentiekio vandeniu taip, kad vanduo nepatektų tiesiai į tepinėlį.

14. Skaidriui išdžiovinamas bibulinis popierius.

15. Slankiklis yra nukirptas į mikroskopo etapą, o tepinėlis stebimas esant mažai galiai ir dideliems sausiems tikslams.

16. Į tepinėlį įpilama panardinimo alyvos lašelis.

17. Tepalas pastebimas pagal naftos panardinimo tikslą.