Su fermentu susietas imunabsorbento tyrimas (ELISA) Antigeno aptikimo metodai

Su fermentu susietas imunabsorbento tyrimas (ELISA) Antigeno aptikimo metodai!

Fermentui arba antikūnui aptikti galima naudoti su fermentu susijusią imunabsorbentą. ELISA metodas turi daug privalumų, palyginti su kitais metodais (27.2 lentelė).

ELISA metodas yra 10–1000 raukšlių, jautresnių nei ankstesni metodai, pvz., Agliutinacija ir imunelektroforezė. Yra įvairių ELISA modifikacijų, kurių kai kurios čia aprašytos.

27.2 lentelė. Fermento imunologinių tyrimų privalumai

1. Fermentų amplifikacijos efektas sukuria jautresnius tyrimus

2. Reagentai turi ilgą galiojimo laiką ir yra palyginti pigūs

3. Gali būti sukurta daug testų konfigūracijų

4. Įranga yra pigesnė ir plačiai prieinama

5. Nėra spinduliuotės pavojaus

6. Galima atlikti ir mažose laboratorijose

ELISA tyrimo antikūnams:

Žinomas antigenas yra padengtas ant mikroliterių plokštelių šulinių (maža plastikinė plokštė, apdorota, kad maksimaliai prisijungtų prie baltymų) yra 96 ​​šulinėlių, kurių tūris yra 200 µl.

↓

Į šulinėlį pridedamas žmogaus bandomasis serumas ir inkubuojamas.

i. Jei serume yra antikūnų prieš padengtą antigeną, antikūnai jungiasi prie antigenų.

↓

Šuliniai plaunami, kad pašalintų nesusietus serumo komponentus.

↓

Prie šulinėlių pridedama fermentų konjuguoto anti-žmogaus imunoglobulino (vadinama konjugatu) ir inkubuojama.

ii. Konjugatas jungiasi su antigenu surištais antikūnais šulinyje.

iii. Jei testo serume nėra antikūnų prieš antigeną, konjugatas lieka tirpale.

↓

Šuliniai nuplaunami, kad pašalintų nesusietą konjugatą.

↓

Prie šulinių pridedamas tinkamas substratas ir inkubuojamas.

iv. Konjugato fermento antigenų-antikūnų-konjugatų komplekse fermentas veikia substratą ir padalija substratą, kad gautų spalvotą produktą. Spalvos raida rodo, kad tiriamame serume yra antikūnų, specifinių ant šulinėlių padengto antigeno.

v. Spalvos nebuvimas rodo, kad bandomasis serumas neturi antikūnų prieš šulinėlius padengtą antigeną.

↓

Reakcijos sustabdymui pridedamas stabdymo tirpalas (paprastai IN sieros rūgštis). Tada plokštelė laikoma ELISA skaitytuve ir matuojamas šulinių optinis tankis (OD). OD atitinka antikūno kiekį tiriamame serume.

Naudojant žinomas antikūnų koncentracijas gali būti sudarytas grafikas. Antikūnų koncentracijos yra brėžiamos ant X ašies, o atitinkami OD rodomi Y ašyje ir sudaroma kreivė. Interpoliuojant bandomosios serumo OD vertę nustatoma antikūnų koncentracija tiriamame serume.

ELISA testo antigenui:

Žinomas monokloninis antikūnas (vadinamas pirminiu antikūnu) ant antigeno yra padengtas ant mikrotitravimo šulinėlių.

↓

Mėginys, kuriame turėtų būti antigenas, pridedamas prie šulinio ir inkubuojamas.

i. Jei mėginyje yra atitinkamas antigenas, antigenas prisijungia prie antikūno ant šulinio ir sudaro antigeno-antikūno kompleksą.

↓

Šuliniai plaunami, kad pašalintų nesusijusias medžiagas.

↓

Prie šulinių pridedama žinoma fermentų konjuguota mAb (vadinama konjugatu) prieš šulinėlius ir plokštelė inkubuojama.

i. Jei šulinėle yra antigenų-antikūnų komplekso, konjugatas jungiasi prie komplekso antigeno.

ii. Jei nėra antigeno-antikūno komplekso, konjugatas lieka tirpale.

↓

Šuliniai plaunami, kad būtų pašalintas nesurištas konjugatas. Pridedamas ir inkubuojamas tinkamas substratas.

i. Jei šulinyje yra konjugatas, konjugato fermentas padalija substratą ir gamina spalvotą produktą.

iii. Spalvos išsivystymo nebuvimas rodo, kad mėginyje nėra antigeno (prieš šulinėlius padengtas antikūnas).

↓

Reakcijos sustabdymui pridedamas stabdymo tirpalas. Atskirų šulinių OD matuojama ELISA skaitytuve. Kaip paaiškinta anksčiau, sudaromas grafikas (sudarytas iš skirtingų antigenų koncentracijų X ašyje ir atitinkami Y ašies OD) ir sudaroma kreivė. Tiriamojo mėginio antigeno koncentracija nustatoma interpoliuojant jos OD.

Antikūnų surinkimo ELISA metodas:

Mikro tiiterio plokštelės šuliniai yra padengti anti-žmogaus IgM antikūnais.

↓

Pridedamas ir inkubuojamas paciento serumas. IgM antikūnai serume prisijungia prie antikūnų prieš žmogaus žmogaus IgM.

Šuliniai plaunami, tada pridedamas ir inkubuojamas žinomas antigenas.

i. Jei šulinyje yra antikūnų prieš antigeną, antigenas prisijungs prie IgM antikūno ir išliks šulinyje.

↓

Šuliniai plaunami, kad pašalintų nesusijusį antigeną

↓

Pridedama ir inkubuojama fermento konjuguota mAb su antigenu.

i. Jei šulinyje yra antigeno (anti-IgM-IgM-antigeno kompleksas), konjugatas prisijungs prie antigeno.

↓

Šuliniai plaunami, kad pašalintų nesusietą konjugatą, ir pridedamas substratas.

i. Spalvos raida rodo, kad paciento serume yra IgM antikūnų prieš antigeną.

ii. Spalvos nebuvimas rodo, kad paciento serume nėra IgM antikūnų prieš antigeną.

↓

Pridedamas sustojimo tirpalas ir šulinių OD matuojami atskirai ELISA skaitytuvu. IgM antikūnų prieš antigeną kiekį galima nustatyti brėžiant grafiką, kaip aprašyta anksčiau.

Panaši procedūra gali būti taikoma IgG antikūnų prieš antigeną nustatymui.

ELISA metoduose paprastai naudojami fermentai yra krienų peroksidazė ir šarminė fosfatazė (27.3 lentelė). Šie fermentai yra kovalentiškai susieti su mAb. Šiems fermentams priklauso įvairūs substratai, gaminantys spalvotus produktus. Kadangi paskutinis ELISA metodo etapas yra fermentinis, ELISA metodas yra labai jautrus (ty yra labai mažos antigeno arba antikūno koncentracijos).

ELISA tyrimų jautrumas padidinamas naudojant papildomus reagentus (pvz., Biotino / avidinimunoanalizę). Pastaruoju metu naudojant krienų peroksidazės substratus, kurie gamina chemiluminescencinius produktus, padidėjo jautrumas. Reakcijos greičio matavimas, o ne reakcijos mastas vienoje fiksuotoje akimirkoje, suteikia tikslesnius kiekybinius ELISA rezultatus.

27.3 lentelė. Fermentų imunologiniuose tyrimuose naudojamų fermentų charakteristikos:

Biotino-Avidin sustiprinta ELISA:

Vietoj ženklinimo mAb su fermentu, MAb gali būti pažymėtas biotinu (vitaminu B ₁₂ ).

↓

Tada pridedamas fermentinis ženklintas avidinas (kiaušinio baltymo baltymų komponentas).

↓

Avidinas prisijungia prie biotino labai jautriai ir jautriai. Vėliau pridedamas substratas. Fermentas (mAb-biotino-avidino fermento) kompleksas veikia substratą ir gamina spalvotą produktą.

Biotino-avidino patobulinimas taip pat naudojamas imunofluorescenciniuose tyrimuose.

Mikrodalelių fermentų imunologiniai tyrimai:

Užuot padengę mikrotitravimo plokštelių šulinius antigenais arba antikūnais, mažos granulės (1 mm skersmens) yra padengtos antigenų arba antikūnų ir atliekami ELISA tyrimai. Mikro dalelės pasižymi didesniu antigenų arba antikūnų dangų plotu, kad būtų galima padengti didesnes antigeno arba antikūno koncentracijas, o tai padeda sutrumpinti laiką, reikalingą surišimo reakcijoms.

Fluorescentinis fermento imuninis tyrimas yra identiškas kitiems PAV, išskyrus tai, kad jie naudoja fluorescuojančius substratus. Fluorescencinėje EIA fluoroforas susidaro fermento reakcijoje. Fluoroforą sužadinus optimaliu bangos ilgiu, spinduliuojama būdinga bangos ilgio šviesa. Išmatuota fluorescencinė šviesa.

Laikas išspręstas fluoroimmunoanalizė:

Šis metodas reikalauja specialių prietaisų ir specialių fluorescencinių etikečių, kad padidėtų tyrimo jautrumas. Šiame tyrime naudojama fluorescencinė etiketė turi vėluojamą fluorescenciją su 100 ns ar ilgesniu laikotarpiu tarp sužadinimo ir emisijos. Dauguma medžiagų, atsakingų už fono fluorescenciją, yra trumpas. Todėl vėluojamo fluorescencijos signalo matavimas sumažins fono fluorescencijos poveikį.

Šis tikslas pasiektas naudojant specialų laiką išspręstą fluorometrą, kuris sukuria greitą šviesos impulsą, kuris skatina fluoroforą. Fluorescencija matuojama truputį po sužadinimo. Taigi, gali būti pašalintas ne specifinio fono poveikis, kuris paprastai mažėja mažiau nei 10 ns.

Fluoroforai, turintys vėluojamą fluorescenciją, yra:

i. Pireno dariniai, kurių skilimo laikas yra beveik 100 ns.

ii. Retųjų žemių metalų chelatų etiketės [pvz., Europium (Eu ³⁺ ), samariumas (Sm ³⁺ ) ir terbiumas (Tb ³⁺ )], kurios labai ilgai trunka apie 50-100 µs.

Chemiluminescencinis imuninis tyrimas:

Chemiluminescenciniai imuniniai tyrimai (CL-EIAs) naudoja chemiluminescencinius substratus, kurie reaguoja su įvairiais fermentais. Chemiluminescencinio substrato ir fermento reakcija sukuria šviesą, panašią į bioluminescenciją. Chemiluminescencinės PAV sistemos yra neabejotinai geresnės nei RIA, atsižvelgiant į jautrumą, laiko efektyvumą ir procedūrinį paprastumą.

Chemiluminescencinės imuninės analizės naudoja chemiluminescencines molekules kaip etiketes.

i. Luminolio dariniai

ii. Acridinio esteriai

iii. Nitrofeniloksalato dariniai

iv. Rutenio tri-bipridilas su tripropilaminu elektrochemiluminescencijai

v. Iš esmės tyrimo metodai nesiskiria nuo RIA / FIA.