Antigenų ir antikūnų papildomieji tyrimai

Antigenų ir antikūnų komplementiniai tyrimai!

Yra metodai, skirti tiksliai nustatyti kiekvieno iš trijų komplemento aktyvinimo kelių komplementų komponentus ir kelis komplemento sistemos fermentus bei reguliatorius.

Tačiau daugelis tyrimų yra prieinami tik mokslinių tyrimų laboratorijose.

Yra dviejų tipų komplemento tyrimai:

1. Analizės, kurios matuoja komplemento baltymus kaip antigenus.

2. Testai, kuriais matuojamas komplemento funkcinis aktyvumas.

Tyrimai, kuriais matuojami komplemento baltymai, kaip antigenai, paprastai yra paprasti atlikti, pigūs, mažiau laiko ir gali būti atliekami daugelyje laboratorijų. Tačiau šie antigeniniai tyrimai nepateikia informacijos apie komplemento komponentų funkcines galimybes, nes šie komplemento antigenų tyrimai nustato tiek funkciniu požiūriu aktyvius komplemento komponentus, tiek komplemento skaidymosi produktus.

i. Paprastai antigeniniai tyrimai nėra tokie jautrūs kaip funkciniai tyrimai.

ii. Antigeniniai tyrimai neatpažįsta žemo komplemento komponentų kiekio tam tikruose kūno skysčiuose.

iii. ELISA tyrimus galima atlikti komplemento komponentų arba kompleksų, kurie susidaro komplemento aktyvinimo metu, matavimui.

iv. Komplekso aktyvavimą per klasikinį kelią galima išmatuoti sekant C4d ir C4 lygius serume.

v. C1r-C1s-C1INH kompleksų ELISA matavimas suteikia komplemento aktyvacijos matą klasikiniu keliu.

vi. Alternatyvaus kelio aktyvavimas gali būti matuojamas ELISA metodu, įvertinant apyvartoje esančių Bb arba C3bBbP kompleksų lygius.

vii. Klasikinio ar alternatyvaus kelio aktyvavimas gali būti stebimas matuojant iC3b lygius arba tirpią membraninių atakų komplekso sC5b6789 formą.

viii. Yra ELISA rinkiniai anafilotaksino C3a ir C5a matavimui serume arba plazmoje.

Papildomų tyrimų pavyzdžių tvarkymas:

Tinkamas mėginių tvarkymas yra labai svarbus komplemento funkciniams tyrimams. Kai kurie komplemento komponentai yra labai labilūs.

i. Daugumai funkcinių tyrimų, pageidautina, kad serumas, o ne plazma, yra priimtinas, nes kalcio chelatoriai (pvz., EDTA, heparinas), naudojami plazmui gauti, gali būti papildomi.

ii. Funkciniams tyrimams kraujas turi užsikimšti kambario temperatūroje 30-60 minučių, o po to - ledui bent vieną valandą.

iii. Clq surišimo tyrimų metu kraujas turi užsikimšti 2 valandas kambario temperatūroje. Krešulys sukamas ir centrifuguojamas 0–4 ° C temperatūroje penkias minutes. Jei įtariama krioprecipituojančių antikūnų, krešulių susidarymas ir kraujo centrifugavimas turi būti atliekamas 37 ° C temperatūroje, nes komplemento fiksacija gali įvykti, jei mėginys atšaldomas.

iv. Serumo arba plazmos mėginiai turėtų būti alikvotiniai keliais mažais kiekiais ir nedelsiant laikomi 40–80 ° C temperatūroje.

v. Kai perduodami serumai, jie turi būti gerai užsandarinti ir įdėti į konteinerius su dideliu sauso ledo kiekiu.

Komplemento funkciniai tyrimai:

Komplekso funkciniuose tyrimuose naudojami buferiai yra labai svarbūs, nes moliarumo ir metalo jonų koncentracijos pokyčiai gali paveikti komplemento titro reikšmes. Klasikinio komplemento kelio CH ₅₀ tyrimas: Paprasčiausias funkcinis klasikinio kelio tyrimas matuoja bendrą hemolizinį kompleksą.

Bet kokio komplemento komponento nebuvimas sukelia nulinį bendrą hemolizinės komplemento titrą (CH50). Paprastai avių eritrocitai naudojami kaip tikslinės ląstelės CH50 arba funkcinės atskirų komplemento komponentų aktyvumo matavimui. Avių RBC yra jautresnės antikūnams ir papildo tarpininkaujančią lizę nei kitų rūšių RBC.

Alternatyvaus komplemento kelio AH ₅₀ tyrimas:

Triušių eritrocitai naudojami AH ₅₀ matavimui. Triušiai RBC yra jautrūs nepriklausomai nuo antikūnų lizės, kurią sukelia žmogaus serumas.

i. CH50 ir AH50 tyrimai yra puikūs atrankos testai, siekiant užkirsti kelią komplemento komponentų genetiniam trūkumui.

ii. Normalus CH50 aktyvumas su sumažintomis AH50 reikšmėmis atsiranda dėl alternatyvių komplemento kelio defektų.

iii. Galutinio komplemento komponentų trūkumai lemia tiek CH50, tiek AH ₅₀ aktyvumo praradimą.

iv. Homozigotinis komplemento komponento trūkumas visiškai panaikina hemolizinį tyrimą.

Hemolizės laipsnį įtakoja daugelis veiksnių, tokių kaip eritrocitų koncentracija, eritrocitų silpnumas (amžius), jautrinimui naudojamas antikūno kiekis, antikūno (IgG arba IgM) pobūdis, buferinės sistemos jonų stiprumas, P ^H, reakcijos laikas, temperatūra ir kalcio ²⁺ arba magnio ²⁺ koncentracijos. CH50 vienetų vertė žmogaus serume apskaičiuojama keliais būdais, pvz., Von krough lygtis.

Atskirų komponentų komponentų funkcinio trūkumo matavimas:

Kai paciento istorija ir simptomai rodo galimą komplemento komponento trūkumą, gali prireikti atskirų komponentų hemolizinių titrų. Norint gaminti eritrocitų lizes, reikalingi viso komplemento komponentų (C1-C9) buvimas ir aktyvinimas. Jei nėra jokio komponento, hemolizė nėra. Reikia nustatyti kiekvienos atskiros komplemento komponento grynus preparatus, kad būtų galima nustatyti konkretaus komplemento komponento nebuvimą paciento serume ar plazmoje.

Norint išmatuoti atskirus komplemento komponentus, reikia iš dalies išgrynintų komponentų. Tačiau C4 matavimas yra išimtis, nes yra C4 trūkumo (C4D) jūrų kiaulių serumo. C2 trūkumų turinčių žmonių ir jūrų kiaulių bei C6 trūkumų turinčių triušių serumai yra keliose laboratorijose.

Atskirų komponentų funkciniai komplemento tyrimai yra jautrūs ir pateikia tikslią informaciją apie komplemento komponento aktyvumą. Tačiau dauguma šių tyrimų yra tik mokslinių tyrimų laboratorijose.

Individualios sudėties komponento matavimas antigeno analize:

Vienintelis radialinis imuninis difuzija yra dažniausias komplemento komponentų, pvz., C3, C4 ir B faktoriaus, kiekybinis nustatymo metodas. Reikia prisiminti, kad visus komplemento funkcinius tyrimus gali slopinti anti-papildomasis serumo poveikis (kuris gali atsirasti dėl antigeno antikūnų kompleksai, heparinas, chelatai ir agreguoti imunoglobulinai).

Papildymo nustatymo testas:

Kai yra antigenų-antikūnų sąveika, komplemento komponentai aktyvuojami ir suvartojami. Todėl in vitro bandymas vartoti komplementą rodo, kad yra antigenų-antikūnų sąveika. Šis principas naudojamas antigeno arba antikūnų aptikimui ir matavimui komplemento fiksavimo teste.

Bandymas atliekamas dviem etapais. Pirmajame etape vyksta antigenų ir antikūnų sąveika, o papildas suvartojamas. Antrajame etape naudojama indikatorių sistema, skirta nustatyti, ar komplementas suvartojamas pirmojo etapo reakcijoje.

i. Jei komplementas suvartojamas pirmajame etape, tai reiškia, kad antigenų-antikūnų reakcija įvyko pirmame etape.

ii. Jei komplementas nevartojamas, tai reiškia, kad pirmojo etapo metu nebuvo antigeno-antikūno sąveikos.

Antikūnų aptikimas papildomo fiksavimo testu:

Pirmas lygmuo:

Išskiriamos žinomos antigeno ir komplemento koncentracijos (paprastai yra šviežios jūrų kiaulytės serumas, naudojamas kaip komplemento šaltinis). Pridedamas ir inkubuojamas serumas, kuriame yra (nežinomų antikūnų).

A. Žinomas antigenas + komplementas + serumas (atitinkami antikūnai). Komplektas suvartojamas inkubacijos metu.

B. Žinomas antigenas + komplementas -1-serumas (atitinkami antikūnai nėra). Kompleksas nėra vartojamas, nes serume nėra antikūnų, kurie yra būdingi žinomam antigenui.

Antrasis etapas:

Į mėgintuvėlius pridedama avių eritrocitų, padengtų triušių anti-avių eritrocitų antikūnais. Esant komplementui, avių eritrocitai bus lizuoti (hemolizė). Nesant komplemento, eritrocitai nesusilieja (be hemolizės).

A. Kadangi komplementas naudojamas pirmojo etapo reakcijoje, antikūnais dengtos avių eritrocitai nėra lizuojami. Todėl hemolizės nebuvimas rodo, kad serume yra specifinių antikūnų prieš tyrime naudojamą antigeną.

B. Kadangi pirmuoju etapu komplementas nėra naudojamas, antrojo etapo metu komplemento hemolizuojami antikūnais dengtos avių eritrocitai. Todėl hemolizės buvimas rodo, kad serume nėra specifinių antikūnų prieš naudojamą antigeną.

Komplekso fiksavimo testai plačiai naudojami klinikinėse laboratorijose ir tyrimuose. Virusai, serumo antikūnai prieš virusines infekcijas, antikūnai prieš Treponema pallidum, sukeliantys sifilį, priešgrybeliniai antikūnai (Coccidioidomycosis immitis, Histoplasma capsulatum), antikūnai prieš Mycoplasma pneumoniae ir antipsickiniai antikūnai nustatomi komplemento fiksavimo testu.