Baltymų baltymas

Baltymų baltymas!

Baltymai denatūruojami 100 ° C temperatūroje inkubuojant su joniniu detergentu (SDS: natrio dodecilsulfatu).

SDS vienodai padengia visus baltymus ir neigiamai veikia baltymų paviršiaus krūvį.

Denatūruotas baltymas elektroforezuojamas poliakrilamido gelyje. Priklausomai nuo jų molekulinio svorio, baltymai atskiriami kaip atskiros juostos.

Atskirti baltymai elektroforetiniu būdu perduodami į filtravimo popierių (nailoną arba nitroceliuliozę).

Tada filtravimo popierius yra inkubuojamas su antiserais prieš baltymus. Antikūnai jungiasi prie jų atitinkamų baltymų antigenų ant filtro popieriaus ir sudaro antigenų antikūnų kompleksus.

Filtravimo popierius nuplaunamas, kad pašalintumėte nesusijusius serumo komponentus.

Į filtravimo popierių pridedamas ir fermentinis žymimas anti-imunoglobulinas (žinomas kaip konjugatas) ir inkubuojamas.

Konjugatas jungiasi prie antikūno antikūnų komplekse filtro popieriuje.

Filtravimo popierius nuplaunamas, kad būtų pašalintas nesusietas konjugatas, o substratas pridedamas ir inkubuojamas.

i. Spalvotos juostos atsiranda vietose, kur yra antigenų-antikūnų kompleksai.

iii. Juostos nebuvimas rodo, kad atitinkamas antikūnas prieš antigeną nėra tiriamame serume.

Antigenais įmirkyti filtrai gali būti laikomi ilgiau.

Vakarų bloto tyrimas plačiai naudojamas hepatito C viruso antikūnų aptikimui ir kaip patvirtinimo testas antikūnų prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV) nustatymui.

Komercinės įmonės filtruoja popierius su atskirtais ŽIV antigenais ir tiekia laboratorijoms. Laboratorijoje paciento serumas pridedamas prie filtravimo popieriaus ir apdorojamas, kad būtų galima nustatyti ŽIV specifinių antikūnų buvimą serume.

Radioimmunoanalizė:

Radioimunoanalizę (RIA) pirmą kartą sukūrė Rosalin Yalow ir Berson (1959). Buvo įdiegta nemažai metodo variantų. Yra du pagrindiniai RIA metodai, konkurencinga RIA ir nekonkurencinga RIA.

Etiketėse naudojami įvairūs radioizotopai (27.4 lentelė), o radioaktyvieji teršalai matuojami skaičiuojant per minutę (CPM), naudojant scenarijų. Populiariausia etiketė, 125 I, reikalauja trumpesnio signalo skaičiavimo laiko, tačiau dėl savo trumpo pusėjimo trukmės ji turi ribotą galiojimo laiką. Tritio (3H) radioizotopams reikia ilgesnio skaičiavimo laiko, taigi padidėja bendras tyrimo laikas.

RIA privalumai:

i. Tikslumas ir aukšta kokybė

ii. Izotopų konjugacija yra lengva

iii. Signalo aptikimas be optimizavimo

27.4 lentelė. Radioimotopų, naudojamų radioimunoanalizėje, savybės:

Izotopas

Pusė gyvenimo

Skilimo tipas

Specifinis aktyvumas (mCi / µmol)

125 I

60 dienų

γ

2200

131 I

8, 1 dienos

, -, γ

16, 100

3 H

12, 3 metų

β-

29

14 C

5760 metų

β-

6062

32 p

14, 3 dienų

β-

9120

Tačiau RIA turi šiuos trūkumus

i. Trumpas reagentų pusėjimo laikas

ii. Radioaktyvumo pavojai.