Imunofluorescencija, naudojama ląstelių antigenų aptikimui

Imunofluorescencija, naudojama ląstelių antigenų aptikimui!

Fluorescentinius junginius, kaip imunocheminius, antigenų aptikimui audiniuose įvedė Coons (1941).

Imunofluorescencija naudojama antigenams aptikti ląstelėse arba audiniuose (naudojant žinomus antikūnus), taip pat antikūnų aptikimą serume (naudojant žinomus antigenus). Fluorescencija - vienos spalvos šviesa, kai medžiaga yra veikiama kitos spalvos šviesoje. Kai fluorescencinė medžiaga yra sužadinama tam tikros bangos ilgio šviesa, ji sugeria šviesą ir skleidžia kito bangos ilgio šviesą.

i. Fluoresceino izotiocianatas (FITC) turi didžiausią šviesos absorbcijos koeficientą esant 490-495 nm, o šviesą skleidžia 530 nm (žalia spalva).

ii. Tetrametilo rodamino izotiocianatas turi didžiausią šviesos absorbcijos koeficientą 550 nm ir išskiria raudoną spalvos šviesą (580 nm).

a. Tiesioginė imunofluorescencija:

Šis metodas naudojamas antigenams aptikti ląstelėse ar audiniuose.

Audinys, kurio antigenas nežinomas, yra pritvirtintas prie stiklo.

Žinomas antiserumas (specifinis dominančiam antigenui), konjuguotas su FIT (žinomas kaip konjugatas) yra padengtas ant audinio ir inkubuojamas.

i. Jei dominuojantis antigenas yra audiniuose, konjugatas jungiasi su antigenu.

Tada skaidrė nuplaunama, kad pašalintumėte nesusietą konjugatą.

Tada skaidrė žiūrima fluorescenciniu mikroskopu.

i. Jei audinyje yra antigeno, bus matoma ryškiai žalia spalva.

ii. Jei audinyje nėra antigeno, visas konjugatas būtų plaunamas skalbimo metu, todėl nėra žalios spalvos.

Šis metodas taip pat naudojamas aptikti bakterijų arba virusų antigenus infekuotuose audiniuose.

b. Netiesioginė imunofluorescencija:

Šis metodas naudojamas antikūnams aptikti serume.

Ląstelės, kuriose yra žinomų antigenų, yra pritvirtintos prie stiklo stiklelio.

Bandymo serumas pridedamas ant stiklelio ir inkubuojamas.

i. Jei serume yra antikūnų (prieš ląstelių antigenus), antikūnai prisijungs prie ląstelių antigenų.

Tada stiklelis nuplaunamas, kad pašalintų nesusietus serumo komponentus.

Pridedama ir inkubuojama anti-žmogaus imunoglobulinas, konjuguotas su FITC.

i. FITC konjuguotas anti-žmogaus imunoglobulinas prisijungs prie serumo antikūnų, prijungtų prie ląstelių antigenų.

Po plovimo skaidrę žiūrima fluorescenciniu mikroskopu.

i. Ryškiai žalia spalva rodo, kad serume yra antikūnų prieš antigenus ląstelėse.

ii. Žalios spalvos nebuvimas rodo, kad nėra antikūnų prieš antigenus naudojamose ląstelėse.